這把新“魔剪”小巧卻高效 基因治療迎來“理想型”工具 兼具活性和編輯范圍優勢

在CRISPR/Cas9基因編輯治療中，小型基因編輯工具可以搭載AAV病毒進入體內，是基因治療的理想工具。不同型號的基因編輯工具是否適合用于基因治療，取決于這把“魔剪”基因大小是否能搭載AAV病毒載體。

日前，復旦大學王永明課題組聯合王紅艷課題組從耳氏葡萄球菌中發現了一把小型的基因編輯工具并將其命名為SauriCas9。這把玲瓏的“剪刀”在基因組中可編輯的位點數量和經典的SpCas9一樣多，而比另一種小型基因編輯工具SaCas9可編輯位點更多。該研究成果填補了我國在鑒定小型CRISPR/Cas9工具領域的空白。新的小型基因編輯工具的發現，彌補了現有基因編輯工具的不足。相關研究成果于近日在線發表于《公共科學圖書館：生物學》

兼具活性和編輯范圍優勢

第三代基因編輯技術CRISPR技術讓基因治療的研究邁上了一個新臺階。在自然界中，CRISPR/Cas9系統是細菌的免疫系統，首先將入侵噬菌體和質粒DNA的片段整合到CRISPR中，然后表達出相應的CRISPR RNA(crRNA)來指導同源序列的降解，從而提供免疫性。王永明告訴科技日報記者，CRISPR/Cas9技術主要面臨兩個核心問題，一個是如何避免脫靶，另外一個是如何擴展編輯范圍。新的小型基因編輯工具的發現主要針對后者展開的研究。

與其他小型基因編輯工具相比，SauriCas9相當于一把靈活而鋒利的小型“剪刀”，能夠包裝在AAV病毒內，且活性高，同時能夠實現比以往發現的小型基因編輯工具更大的編輯范圍。SauriCas9通過AAV病毒包裝后，在多種細胞類型中實現了基因編輯，說明SauriCas9具有用于基因治療的潛力。

“SauriCas9基因大小為3100個堿基對，與另一種小型基因編輯工具SaCas9大小差不多，同時比經典的SpCas9要小1000個堿基對。SaCas9比SpCas9小很多，但是編輯范圍不如SpCas9大。”王永明表示，SaCas9來源于金黃色葡萄球菌，是第一個被用于基因治療研究的小型基因編輯工具。另外還有3個小型編輯工具NmCas9、Nme2Cas9、CjCas9，但是它們的編輯效率偏低。SpCas9來源于化膿性鏈球菌，雖然編輯范圍大，但是不能被包裝在AAV病毒中，用于基因治療面臨困難。

基因編輯工具的來源不同，基因編輯范圍和效率也不同。SpCas9是所有基因編輯工具中效率最高的，同時編輯范圍也大。“SauriCas9出現兩個連續的G序列就可以進行編輯，而SaCas9需要4個堿基組合才能編輯，這樣出現的頻率低，編輯范圍就不如SauriCas9大。”王永明說。

王永明課題組對公共數據庫中的30個不同種類CRISPR/Cas9進行一一測試驗證，發現其他29個Cas9均不適合用于基因編輯，只有SauriCas9具有編輯活性，很適合作為基因編輯治療的工具。

用于藥物靶點的高通量篩選

CRISPR/Cas9系統包括兩個元件，分別是Cas9內切酶和guide RNA(gRNA)，gRNA引導Cas9蛋白在靶位點進行切割，形成DNA雙鏈斷裂(DSB)。細胞的修復系統修復雙鏈斷裂的DNA時，會定點產生突變，這就是基因編輯。以往SpCas9通過與氨基酸融合實現堿基轉換。在發現了SauriCas9之后，研究團隊將其與氨基酸融合制作了兩種新的堿基編輯器——SauriCas9BE4max和SauriCas9ABEmax，分別可以實現C-T或A-G兩種堿基轉換。“由于SauriCas9可以識別更多的位點，其編輯器的修復范圍也相應比SaCas9更大。” 王永明說。

CRISPR/Cas9技術的安全性也是科學家研究的關注點，通常與基因編輯工具的精準度相關。據王永明介紹，基因治療方式可以分為兩種，一種是將細胞從體內分離出來，在體外進行突變糾正，然后再輸回體內。另外一種治療方式是將CRISPR/Cas9系統直接導入體內治療疾病。但是CRISPR/Cas9技術可能會造成脫靶修飾，帶來難以預料的風險。

SauriCas9的精準度介于SpCas9與SaCas9之間。SaCas9的精準度更好，意味著更具安全性。研究組將SauriCas9部分序列和SaCas9基因序列互換，得到了嵌合體Cas9，保證了精準度的同時也能擴大編輯范圍，使基因編輯工具得到了進一步優化。

后續的研究中，王永明課題組還將對新的基因編輯工具進行安全性測試驗證，擴展其在高通量篩選等方面的應用。“人類大約有2萬個基因，利用CRISPR/Cas9可以分別敲除這2萬個基因，敲除過程可以用高通量實現，這樣就可以快速研究這些基因的功能，為藥物研發提供靶點。”王永明介紹。

(侯樹文 記者 王 春)